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临床检验仪器学笔记 02 第二章 光谱分析仪器与技术

学习目标

掌握:光谱分析技术的分类,各类分析技术的特征;紫外可见分光光度计工作原理、紫外-可见分光光度计的基本结构及各部件的基本功能;荧光分析的基本原理、原子吸收分光光度计和原子发射光谱仪的基本原理;散射光谱技术分析方法分类及其检测原理

熟悉:紫外-可见分光光度技术定量分析的方法、紫外可见分光光度计的基本类型及其特点、原子分光光度计分析条件的选择原则、荧光光谱仪的基本结构;浊度分析的基本原理及基本分析方法。

了解:光的基本性质和朗伯-比尔定律的意义分光光度计分析条件的选择;影响荧光强度的因素;原子光谱分析仪及散射免疫比浊分析技术的临床应用

重点

一、紫外-可见分光光度计的工作原理

紫外-可见分光光度计的工作原理遵循朗伯-比尔定律

设入射光强度为I0,当透过浓度为C、液层厚度为b的溶液后,透射光强度为I,透射光强度与入射光强度的比值称为透光度,也叫透射率,以T表示。当液层厚度b或溶液浓度C按算术级数增加时,透光度T按几何级数减少,数学表达式为:

$T = \frac { I } { I _ { 0 } } = 10 ^ { - K C _ { b } }$

式中K为比例常数。

在光谱分析中,常常用吸光度表示溶液对入射光的吸收程度。

吸光度与透光度的关系是:吸光度等于透光度的负对数,用A表示吸光度,有下列公式关系。

$A = - \lg T = - \lg \frac { I } { I _ { 0 } } = \lg \frac { I _ { 0 } } { I } = \lg \frac { 1 } { T } = K C b$

二、紫外-可见分光光度计的基本结构及各部件功能

紫外可见分光光度计的基本结构由

光源单色器吸收池检测器信号显示系统,5部分组成。

三、紫外-可见分光光度计的基本类型

紫外-可见分光光度计可以按仪器的使用光波长分类,也可按仪器的光学系统分类。

使用波长分类可分为:

  • 紫外分光光度计(0.1 ~ 200nm)
  • 可见分光光度计(360~800nm)
  • 紫外-见分光光度计(200~1000nm)
  • 紫外-可见-红外分光光度计(200 ~ 2500nm)

光学系统分类可分为:

  • 单光束分光光度计
  • 双光束分光光度计
  • 双波长分光光度计
  • 双波长-双光束分光光度计
  • 动力学分光光度计

四、紫外-可见分光光度技术定量分析的方法

定量分析主要包括

  • 直接比较法
  • 吸光系数法
  • 双波长分光光度法

五、原子吸收分光光度计的基本工作原理

原子吸收分光光度法是根据处于气态的基态原子在某特定波长光的辐射下,原子外层电子对光的特征吸收这一现象建立起来的一种光谱分析方法。

其方法原理是以测量气态基态原子外层电子对共振线的吸收作为基础的分析方法。测量原子吸收光谱,就可以对物质进行定性分析。

六、荧光光谱仪的基本原理

对于某一荧光物质的稀溶液,在激发光的频率、强度以及液层厚度不变时,此荧光物质所发出的荧光强度与溶液的浓度成正比关系。由此可以通过测定荧光强度来求出该物质的含量。

荧光分析法和紫外、原子吸收分析方法有本质的不同,它所测量的是待测物质所发射的荧光强弱,不是物质对光谱的吸收强弱,属于发射光谱分析。

七、浊度分析的基本方法

根据检测器的位置及其接收光信号的性质,浊度分析可分为透射免疫比浊法和散射免疫比浊法两大类,前者是在0°角,亦即在直射角度上测定透射光强度和被测溶液中微粒浓度关系的方法,可用分光光度计及比色计进行测定,透射免疫比浊法测定的信号主要是溶液的光吸收及其变化,即溶液的光吸收因散射作用造成的总损失之和,后者则是在5°-96°角的方向上测量散射光强度和被测溶液中微粒浓度关系的方法,后者则需专用的浊度计。


难点

一、紫外-可见分光光度计的分类与结构特点

紫外可见分光光度计可以按仪器的使用光波长分类;也可按仪器的光学系统分类。

使用波长分类可分为:

  • 紫外分光光度计(0.1 ~ 200nm)
  • 可见分光光度计(360~800nm)
  • 紫外-见分光光度计(200~1000nm)
  • 紫外-可见-红外分光光度计(200 ~ 2500nm)

光学系统分类可分为:

  • 单光束分光光度计
  • 双光束分光光度计
  • 双波长分光光度计
  • 双波长-双光束分光光度计
  • 动力学分光光度计

二、单色光的产生与颜色互补

(1)单色光的产生

紫外-可见分光光度计所用的光源,发射光的光谱是连续的光源。而被测物质所需要的光是单色光,需要在连续的光谱中分离出单一波长的单色光单色光是由单色器产生的,用于分光光度计上的单色器主要有棱镜单色器和光栅单色器两种。

棱镜单色器的分光原理是光的折射原理,不同波长光的折射率不同,当一束平行的混合光进入棱镜单色器后就会按波长顺序分解成各种单一波长的单色光,根据需要选择不同波长的光。

光栅单色器是利用光的行射和干涉原理进行分光的。

(2)互补光

如果将两种颜色的单色光按一定的强度比例混合可以成为白光,这样的两种光互称为互补光。

紫外-可见分光光度计的可见光谱分析要求被测溶液的颜色与所用的单色光互补,以求达到溶液对光的最大吸收。

在某些方法学研究中要预先测定某种溶液的最大吸收光的波长。

三、原子吸收光谱仪和原子发射光谱仪的工作原理

区别原子吸收光谱仪基本工作原理是测定气态的自由原子对某种特定光谱的吸收。原子发射光谱法是根据处于激发态的待测元素原子回到基态时发射的特征谱线对待测元素进行分析的方法。

四、雷菜( Rayleigh)光散射理论与米-德拜( Mie- Debye)散射理论

粒子被光照射后而发光,这一现象主要取决于粒子的大小,即当粒子直径大于入射光波波长的一半( 半波长)时就发生散射现象,雷莱对小粒子溶胶系统进行研究后,于1871年总结出反映粒子对入射光散射作用的有关因素相关的公式,即

$I = \frac { 24 \pi ^ { 3 } \nu V ^ { 2 } } { \lambda ^ { 4 } } ( \frac { n _ { 2 } ^ { 2 } - n _ { 1 } ^ { 2 } } { n _ { 2 } ^ { 2 } + 2 n _ { 1 } ^ { 2 } } ) ^ { 2 } I _ { 0 }$

式中:I0即入射光强;λ即入射光波长;n1、n2即分散介质和分散相的折射率;ν即单位体积内的粒子数;V即单个粒子的体积;

由上式可得出如下结论:

(1)单位体积的散射光强度与每个粒子体积的平方成正比;

(2)散射光总能量与入射光波长的四次方成反比。入射光波长愈短,散射愈显著;

(3)分散相与分散介质的折射率相差愈显著,则散射作用亦愈显著;

(4)散射光强度与单位体积中的粒子数成正比;

该公式仅适用于稀释溶液,微粒直径约为入射光波长的1/20 ~ 1/10的溶液。而当粒径与入射光波长的比例大于该比值时,各方向散射光的强度不尽相同,即成为不对称或各向异性的了,此时正向散射光强度趋于增强。这种情况实际上偏离了雷菜提出的公式,为此Mie和Debve(米一德拜)先后对雷菜公式加以修正即

$I = \frac { 24 \pi ^ { 3 } \nu V ^ { 2 } } { \lambda ^ { 4 } } ( \frac { n _ { 2 } ^ { 2 } - n _ { 1 } ^ { 2 } } { n _ { 2 } ^ { 2 } + 2 n _ { 1 } ^ { 2 } } ) ^ { 2 } ( 1 + \cos ^ { 2 } \theta )I _ { 0 }$

公式进一步表明检测器的位置与被测光信号的性质及强度之间的关系。米-德拜所
做的修正更适合于粒径等于或大于入射光波长的情况。在免疫化学反应过程中,可溶性
抗体( Ab)与可溶性抗原( Ag)反应,形成免疫复合物( IC)粒子,混合物系统中的粒子由小变大,并不恪守某一固定公式。故而米-德拜对雷菜散射理论的修正公式更适合于现代实验室测定项目的原理。目前这个液相化学公式主要被应用于免疫检测系统中,常称为免疫浊度法。

本文标题:临床检验仪器学笔记 02 第二章 光谱分析仪器与技术

文章作者:cunzher

发布时间:2020年07月23日 - 18:07

最后更新:2020年07月23日 - 19:07

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